栀子及其复方栀子鼓汤长期用药

潜在安全风险研究及建议

文/田婧卓 通讯作者/梁爱华、易艳 赵雍 李春英 张宇实 韩佳寅 刘素彦 鲜中 李桂琴 王连帽

 ---文章选自中国食品药品监管杂志

基金项目

国家“重大新药创制”科技重大专项(201 52 x09501004)

北京市科技计划项目(2 15100001 5012,2161 10000491 6025)中国中医科学院科技专项(Z210025)

【摘要】目的:通过栀子苷、栀子水提物和栀子豉汤给大鼠反复用药6个月的安全 性研究,为含栀子药物的临床合理用药和风险控制提供依据。方法:SD大鼠随机分为对照组和三个给药组(栀子苷组,栀子水提物组和栀子豉汤组),三个给药组的剂量均以栀子苷计相同(50毫克/公斤),各组每日灌胃给药1次,连续6个月。于给药后1、3.6个月和给药6个月后停药1个月分别处死一批动物,采集血、尿脏器等进行血液学,血液生化学,尿常规,凝血,脏器病理等分析。结果:三个给 药组雌、雄动物在1个月和3个月结束时,除了肝、肾颜色稍深染以外,未见其 他明显异常反应,检查的各脏器组织均未见与药物相关的病理损伤。给药6个月后, 肉眼可见肝脏和肾脏颜色深染;显微镜下可见肝细胞和肾小管细胞中有呈棕色的 药物颗粒沉积于胞质,颗粒明显处可见组织细胞损伤。肝脏可见肝细胞轻度变性、 胆管增生和炎性细胞浸润。肾脏可见肾小管细胞肿胀、细胞脱落等。栀子苷组与 栀子水提物组的肝肾病理改变相近,栀子豉汤组相对较轻。肝肾功能生化分析只 有个别指标的改变有统计学显著性意义,但总体上仍在正常值范围内波动。停药1 个月后,脏器内的药物沉积情况明显减轻,肝肾组织形态学与对照组无明显差异。

结论:栀子及其复方长期用药(26个月)可造成药物在肝脏和肾脏蓄积,并造 成潜在的肝肾毒性,与栀子昔有关。建议”中国药典“栀子的1含量测定】项下对栀子苷制定最高限量;1用法与用量1项下增加“不宜长期用药”。另外,建议 将栀子从《既是食品又是药品的物品名单》中移除,以避免作为食品长期服用而 造成的风险。

【关键词】栀子苷;栀子水提物;栀子豉汤;长期毒性反应

    栀子是茜草科植物栀子的果实, 1 床上应用广泛,属于卫生部门颁布的3 一批药食两用资源。据子的主要化学压 分包括环烯醚萜苷类栀子苷、栀子苷酸 二萜类西红花苷和藏红花酸、黄酮类材 子素、有机酸酯类绿原酸及栀子苷的 解产物京尼平1"。栀子的药理作用主要包括保肝利胆,对急慢性肝损伤12.1,胆汁淤积性肝损伤”,非酒精性脂肪肝炎[1肝纤维化及肝癌1均有明显的治疗作用,此外还有抗炎,治疗神经退行性疾病,糖尿病,心脑血管疾病的作用”,栀子昔是栀子的主要活性成1分,在某些情况下也可能造成一定的肝损伤10。前期研究表明,大鼠长时间灌胃给予栀子苷(栀子昔100毫克/公斤,连续用药6个月)可引起一定程度的肝肾损伤。由于栀子苷仅为扼 子的成分之一,临床并不使用栀子苷,而 是使用栀子或含栀子的复方,因此有必要 研究栀子以及含栀子的复方是否会产生与 栀子苷类似的潜在毒性,为临床用药提供 安全性信息。

本研究采用栀子苷、栀子水提物和 含栀子复方平行对比进行大鼠灌胃给药6 个月加停药1个月的长期毒性实验,重 点考察对肝肾的潜在毒性。栀子水提物和 复方均以栀子苷调整为同等剂量。复方采 用栀子豉汤。该方由栀子和淡豆豉组成, 出自《伤寒论》,是清宣郁热除烦的经典方。淡豆豉有健胃助消化、抗痴呆、抗氧化、 抗自由基和保护心血管的作用10,现代保证治疗效果。因此,本研究以栀子豉汤 为复方代表进行大鼠长期用药的潜在毒性 观察。

1.材料

1.1供我品

栀子昔(批号:S140807)、高效液相色谱法测定含量为97.122%,购于北京赛白草科技有限公司。使用时现用现配,用纯 净水配制。栀子(批号:14011008)高效液相色谱法测定原药材中栀子昔的含量为5.675%,购于北京仟草中药饮片有限公司。采用常规水煎法制备栀子水提物(北京市卫生局临床药学研究所制备),浓缩为棕黑色膏状,栀子苷含量为8.7258%,用纯净水稀释后灌胃用。淡豆豉(批号: 140227001),购于北京仟草中药饮片 有限公司。栀子豉汤制备:采用栀子:淡 豆豉=1:1混合,采用水煎法制备为棕 黑色膏状。栀子豉汤中栀子昔的含量为4.0365%。

1.2动物

健康SPF级SD大鼠160只,雌雄各半,6 - 7周龄,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2012 - 0001年,合格证号:11400700099088。动物饲养于中国中医科学院医学实验动物中心动物房,采用人工光照,屏障系统,12个小时明暗交替,换气次数不少于15次/小时,室内温度控制在20-26℃,湿度为40% - -70%,自由设施饮水,每笼5只。所有大鼠检疫适 应5天后进行实验。本实验由中国中医 科学院中药研究所动物伦理委员会批准, 依照实验动物应用伦理准则进行实验,实验的相关步骤均遵照此规定。

1.3仪器

动物天平(缝匠肌),全自动生化分析仪(东芝),尿液分析仪(西门子Clinitek),血凝仪(普利生),全自动血液分析仪(西门子)电解质分析仪(书),光学倒置显微镜(奥林巴斯),全自动脱水机(Shandon),石蜡包埋机(Microm),石蜡切片机(热),全自动染色机(Microm),高速冷冻离心机(σ)等。

2．实验方法

2.1分组及给约

将SD大鼠随机分成4组:对照组,栀子昔组(京尼平甙)50毫克/公斤,栀子水提物(AEFG) 573毫克生药/公斤组,栀子豉汤(GSPD) 1.239克生组药/公斤。

除对照组外,其他三组的栀子苷剂量相等(50毫克/公斤)。每组40只动物,雌 雄各半。对照组灌胃给予纯净水。其他 组分别给予不同的药物,每日给药1次, 连续给药,最长周期为6个月。分别于 给药1、3、6个月结束时,各组分别处 死雄性和雄性各5只动物,收集各种生 物样本。各组其余动物于停药恢复1个 月后再处死。各时间点的生物样本和检测分析按照以下“2.2观察及检测指标”中描述的方法进行。

2.2观察及检测指标

每周称取1次未禁食体重和摄食量, 于给药前后及恢复期观察大鼠的一般状态 (动物外观、行为活动、神态步态、尿液 粪便等)。

给药1,3.6个月和恢复期结束时,

用大鼠代谢某收集尿液,进行尿液常规检

章(尿量、pH值、比重,葡萄糖、尿置白,

假灯素,尿胆原,酮体,潜血,亚硝酸盐白烟胞),各时间点抽取血液,进行血液学检测(血红蛋白,红细胞计数,白细胞计数,血小板计数、网织红细胞计数,红细胞相关指标,血小板相关指标等);凝血指标检测(派血酸原时间,活化部分凝血活酸时间):血液生化学检测(天门冬氨欣氨基转移酶,丙氨酸氨基转移酶,瞬性磷根額,y -谷氨酰基转移酶,总胆固

B,总胆红素,5 '一核苷酸,肌酐,尿素领等),电解质检测(钠,钾,氯),解剖并摘取註器称重,计算脏器指数(弹心,肝,肺,肾,肾上腺,脑,胸踝,翠丸,附案,卵巢,子宫)。此外，还摘取了胃、 大小际、垂体、气管食管、甲状腺、肤腺、 嘻液器、前列腺、跨胱、脊髓、胸骨等脏 器或组织，进行病理学检查。

2.3统计学分析

体重、摄食量、血液生化学、脏器指数、

尿量、血液学、凝血指标均以平均值士

标准差表示,用单因素方差统计:尿常规分析应用Kruskal-Walls MannWitneys U检验方法。比较各给药组与对照组之间的差异,当Pe0.05时认为差异有显著性。

3.实验结果

3.1橱子苷、AEFG GSPD对动物一般状况无明显影响

对照组和栀子苷、AEFG GSPD各给药组动物在实验期间均未见死亡,般状况好,外观,行为活动,神态步态和粪便均未见异常。三个给药组的动物体重和摄食量与对照组比较均无明显差异(数据未列示),提示药物对体重增长和食量无明显影响。栀子苷组尿液颜色加深呈棕色和黄绿色; AEFG和GSPD组均呈绿色和墨绿色。

3.2长期用药后可造成肝脏和肾脏药物蓄积并导致肝肾损伤

给药3个月后,栀子苷组、AEFG组和GSPD组的肝脏和肾脏颜色均加深,呈现绿染现象,给药6个月后更明显,肝肾均呈墨绿色，对照组和AEFG组的肝脏颜色见图1。停药1个月后,肝、肾绿染情况明显好转,顾色基本恢复正常。

给药1个月后雌性大鼠AEFG组的肝指数和肾指数显著升高。给药3个月后雄性大鼠栀子苷组,AEFG组和GSPD组的肝指数均显著高于对照组,其他各给药时间点的脏器指数未见异常改变。恢复 期结束后雄性大鼠各组之间的脾指数和肺 指数有显著差异,而雌性大鼠栀子苷的肾 指数显著降低。除上述变化之外,各给药 组的心脏、肺、脑、胸腺、睾丸、附睾、 卵巢、子宫器官指数与对照组无显著差异。

图2显示的是不同时间点有统计学显著 性的肝肾指数结果。

显微镜检查可见,给药1个月和3 个月后,各给药组雌性和雄性动物的肝 脏组织与对照组比较无显著异常。给药6个月后,栀子昔组,AEFG和GSPD各给药组雌、雄大鼠的肝细胞浆内均可见药物颗粒沉积,弥漫性分布,以中央静脉周围更明显,有的动物伴有轻度至中度胆管增生,其中AEFG组胆管增生明显(5只雄性大鼠中有3只达到中度胆管增生)。

此外,GSPD组1/5只雄性大鼠的肝组织中可见类肉芽肿,见图3和表1所示。雌性AEFG组3/5只动物可见肝细胞核固缩,栀子苷组1/5只动物有类似改变,见表1,雌性大鼠肝组织异常程度略低于雄性。停 药1个月后,各给药组肝细胞内药物沉 积颗粒明显减少。

栀子苷组,AEFG和GSPD各组给药1个月和3个月,各组肾脏组织结构与对照组比较无显著异常。但给药6个月后各给药组雌、雄大鼠肾组织均可见异 常改变，包括肾小管肿胀、上皮细胞脱 落、炎性细胞浸润、管腔内见渗出。此外,各给药组雌性和雄性大鼠的肾小管细胞内均可见棕色的药物颗粒沉积,其中,雄性大鼠栀子苷组和AEFG组各有3/5只大鼠可见较多的颗粒样物质沉积,见图4和表1所示。此外,雄性大鼠GSPD组有115只大鼠肾脏组织可见大量的炎性细胞浸润,见表1,雄性大鼠肾组织异常程度略低于雌性。停药1个月后,各给药组 肾小管细胞内药物沉积颗粒明显减少。图 3和图4显示的是代表性肝脏和肾脏病理 形态变化。

除肝肾组织外，各给药组的其他脏器 或组织心脏、肺、脑、脾脏、胃、大肠、 小肠、垂体、气管、食管、甲状腺、胰腺、 唾液腺、前列腺、膀胱、脊髓等未见明显 病理变化。

3.3血液生化学结果

栀子苷.AEFG和GSPD给药1个月和3个月后,各给药组总胆红素(治疗组)明显降低,与栀子的药效有关。雄性大鼠给药3个月后栀子昔组的y -谷氨酷基转移酶(y-GT)显著升高。除此之 外,三个给药组给药3个月后其他生化 检测结果均未见明显异常。给药6个月后,GSPD组雄性大鼠的y-GT和尿素氢(包子)较对照组显著升高(PC0.05),见图5 a和B,但y-GT和包的上升幅度有限,治疗组结果显著降低(图5 C和D, P < 0.01),停药后1个月,各给药组血液生化学指标未见异常。

3.4尿液和血液学分析

尿液学分析结果显示,给药1个月 和3个月后,各给药组与对照组相比无显 著差异。给药6个月后,栀子苷组雄性大鼠的尿液胆红素(BIL)和雌性大鼠的BIL和尿胆原(URO)与对照组相比有显著增高(P < 0.05), AEFG组雄性和雌性大鼠的URO。BIL和雄性大鼠的亚硝酸盐,雌性大鼠的酮体(刃)与对照组相比有显著增高(P < 0.01), GSPD组的雌雄动物的活性增加。URO和尿蛋白(PRO)显著增高(Pc0.05)恢复期结束后,各恰药组与对照组相比均无显著差 异。由于各给药姐的尿液爱药物的影响而 颜色明显加深,因此不能排除尿液中药物 顾色对上述尿液指标分析的干扰和影响。

血常规分析结果显示,给药6个月后,栀子苷,AEFG, GSPD组雌性动物网织红细胞比例较对照组显著增高。

除此之外,栀子苷,AEFG, GSPD各给药1、3、6个月后雌、雄大鼠虽然有少数血液学指标与对照组比较具有显著差异,但各项血液学指标值均在正常范围波动,不认为有毒理学意义。

4．讨论

4.1含栀子的药物长期用药可造成带积性肝肾损伤,临床不宜长期用的药

栀子在中成药中应用广泛,主要用于 实热、火毒雍盛、湿热黄疸等,用于这些 目的时通常用药时间较短。然而,由于栀 子有清热除烦功效,目前栀子在临床上也 被用于治疗慢性肝炎、抑郁症和糖尿病等 慢性疾病1011临床发现,病人如果服 用含有栀子的中成药时间稍长(3个月左 右)，可见皮肤深染发绿现象。在本研究中,我们发现栀子苷,AEFG和含栀子的复方GSPD长期用药后,均可见药物成分在肝,肾组织中蓄积,肉眼可见肝肾颜色变深,呈现绿色或墨绿色;显微镜下 可见肝脏细胞、肾小管细胞胞质中有弥漫 性药物颗粒沉积,同时造成一定的肝、肾 细胞损伤,其中药物沉积量多的细胞病变 更为明显。而血液生化分析显示肝肾功能相关的指标除了y-GT和包升幅有限的增高外,其他指标并无显著异常。结 果提示,常规的血液生化指标检测可能无 法准确预测栀子及其复方的肝肾损伤。本实验中AEFG, GSPD和栀子苷组均设计为相同的栀子苷剂量,三个给药组具有剂量可比性,以便于客观比较三者的毒性反应。栀子在临床上的日用量为6-10g,”中国药典》2015年版规定栀子中栀子苷的含量不得小于1.8%,而市面上栀子中栀子苷的最高含量可达6%。以栀子苷含量中位水平4%计算,大鼠服用栀子音50毫克/公斤相当于人体(60公斤重)服用栀子剂量为11 g生药,接近临床剂量。

本研究提示,即使是采用栀子的临床剂量, 如果长期用药也可能造成药物蓄积,并造 成肝肾毒性。因此,临床上使用含栀子的 药物时应注意用药时间不宜过长。

4.2栀子的肝肾毒性与栀子苷有关本实验室以往的研究已经报道过栀子苷过高剂量或者长期用药均可造成肝肾毒性,其毒性表现与本研究类似。本研究采用栀子苷,AEFG, GSPD平行设计,三组的剂量按照栀子苷计均相同(50毫克/公斤),三组给药6个月后肝脏和肾脏均发生了明显的药物蓄积,同时部分肝肾组织有毒性表现。其中栀子营组和AEFG组在肝肾细胞内药物蓄积以及组织损伤上虽有微弱差异,但是基本类似和相近,说明栀子产生的药物蓄积主要是栀子昔引起的,其肝肾毒性可能与栀子昔有关,这个与以往的报道相类似(。GSPD组的肝肾损伤作用与另外两组相比程度明显较低,提示栀子复方中的配伍应用可能有助于减轻栀子昔的肝肾毒性作用,这与前期研究结论相类似12

4.3(中国药典”关于栀子的质量标准应增加栀子苷最高限量和不宜长期用约的提示

本研究显示,大鼠给予栀子苷,AEFG, GSPD 1个月和3个月肝肾组织损伤尚不明显,而长期用药6个月出现了肝肾毒性。结果提示:在一定的剂量下 将给药时间限定在一定范围内可能相对安 全。由于栀子药材中栀子苷含量范围差异 较大,我们从市场购买的栀子的栀子苷含 量接近6%,相当于年版规定的栀子苷限量标准(1.8%)的3倍余。前期研究我们发现栀子苷过高剂 量即便是短期使用时也可造成肝脏和肾脏 毒性。因此,根据本研究,我们建议《中 国药典》中栀子的1含量测定1项下,不 仅对栀子昔的最低含量做出规定,还需要 对栀子苷的最高含量制定限量标准,以降 低可能摄入过量的栀子苷而导致肝肾毒性 的风险。另外,为了避免长期用药产生毒性,应在1用法与用量1项下增加“不宜长期用药”

4.4建议将栀子从“既是食品又是药品的物品名单”中移除

除了在药品中使用外,栀子被列于《既是食品又是药品的物品名单》上,因此其 在食品和保健食品中的应用越来越广泛。

据统计,含有栀子的保健品有70余个, 涉及保健功能有18种,包括对化学性肝 损伤有辅助保护作用、免疫调节、抗疲劳、 祛痤疮、改善睡眠、辅助降血脂等。作为 食品和保健品应用时,长期食用的可能性 较大。由于人们通常认为食品与保健品具 有较高的安全性,因此服用剂量和使用时 间随意性较大。鉴于栀子的蓄积性相对比 较明显,长期用药具有潜在风险,建议将 扼子从《既是食品又是药品的物品名单》。

作者简介

田卓,博士

通讯作者:梁爱华,博士,研究员,中药注射剂安全性研究中心主任

本文所有作者单位均为中国中医科学院中药研究所,北京市中药鉴定与安全性检测评估司点实验室,创新天然药物与中药注射剂国家重点实验室

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