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中国畜牧兽医杂志在线阅读
不同生物型 BVDV 感染宿主细胞后差异基因分析
程凯慧,朱彤,侯佩莉,王洪梅,苗自利,张亮.解晓莉,杨宏军",何洪彬
(山东省农业科学院奶牛研究中心,济南 250131)
----文章选自中国畜牧兽医杂志
摘要：为深人研究牛场中普遍存在的持续性感染,探讨不同生物型牛病毒性腹泻病毒(bovine virai diarthea virus.BVDV)转化的分子机制,本试验将致细胞病变型 BVDV(CP 型 BVDV)和非致细胞病变型 BVDV(NCP 型BVDV)感染 MDBK 细胞,观察细胞变化,感染后 12～72 h 期间每间隔 12 h 收集 1 次细胞,同时对 24、48 h 收集的细胞进行转录组学分析。结果显示.不同生物型 BVDV 感染宿主细胞 24 h 后,与感染 NCP 型 BVDV 的细胞相比。感染 CP 型 BVDV 的 MDBK 细胞中上调差异表达的基因 2 849 个,下调差异表达的基因 3 347 个,48 h后,上调差异表达的基因 2 933 个,下调差异表达的基因 2 831 个。对差异基因的 GO 功能分析结果表明,差异基因参与的分子功能主要有催化活性、结合活性,酶调节活性、分子转导活性和蛋白结合转录因子活性等;Pathway 显著性富集分析结果显示,差异表达基因主要参与细胞自噬、细胞凋亡、免疫调节因子等相关的信号通路。本试验结果可为进一步揭示病毒致病的分子机制,控制 BVDV 和研制其候选疫苗奠定基础。
关键词：致细胞病变型 BVDV:非致细胞病变型 BVDV+差异基因:GO功能分析:Pathway 显著性分析
中图分类号:5855.3 文献标识码:A 文章编号：1671- 7236(2017)11-3113-08
Differential Gene Analysis of Host Cell Infected by Different
Biotypes of Bovine Viral Diarrhea Virus
CHENG Kai-hui， ZHU Tong, HOU Pei-li, WAMG Hong-mei，MIAO Zi-i, ZHANG Liang,
XIE Xiao-li， YANG Hong-jun”，HE Hong-bin'
(Dairy Cattle Rexearch Center, Shandong Academy of Agriculural Sciences，Jinan 250131, China）
Abstract: In order to further study the problem of persistent infection and investigatc the molecular mechanism of transformation between different biotypes of bovine viral diarrhea virus
(BVDV),cytopathic BVDV(CP BVDV) and non cytopathic BVDV(NCP BVDV) were used to infect MDBK host cell and the cells were observed and collected per 12 h from 12 to 72 h ,and at the same time the transcriptome analysis were used to analyse the 24 and 48 h MDBK cells. The results showed that at 24 h,compared to MDBK cell infected by NCP BVDV,there were 2 849 up regulated and 3 347 down-regulated differential genes,while 2 933 up-regulated and 2 831 down-regulated differential genes at 48 h in MDBK cell infected by CP BVDV. The results of GO function classification statistics showed that the molecular function of differential gene mainly involved in catalytic activity, hinding activity, enzyme regulator activity,molecular transduction activity and protein binding transcription factor activity. Pathway saliency map showed that the genes involved in autophagy, apoptosis, signal transduction related expression of immunoregulatory factor were preliminary screened. The found of differential gene laid the foundation to further reveal the molecular mechanism of viral pathogenesis, also provided molecular targets for the
Key words: cytopathogenic BVDV(CP BVDV);non cytopathic BVDV(NCP BVDV);differential development of new anti BVDV preparations. gene;GO function analysis; Pathway analysis .
牛病毒性腹泻/黏膜病(bovine viral diarrhea/mucosal disease,BVD/MD)是由牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的一种重要动物传染病,主要侵害牛、羊等反刍动物。该病临床上主要以发热、腹泻和咳嗽为特征,可引发持续性感染,免疫抑制和母畜流产等,呈世界性流行,对畜牧业危害巨大。BVDV 属于黄病毒科瘟病毒属,单股正链 RNA 病毒,基因组全长约 12.3 kb,包括 1个开放阅读框、5'非翻译区(5'-UTR)和 3'非编码区,其阅读框编码 1 个由 3 898～3 988 个氨基酸残基组成的多聚蛋白,在宿主细胞信号肽酶和病毒非结构蛋白的作用下,加工为成熟的蛋白,其中 C、Erns、E1 和 E2 为结构蛋白,p7、NS2/3、NS4A,NS4B、NS5A 和 NS5B 为非结构蛋白”*。近几年流行病学调查发现 BVDV 感染率高达56.5％,不同地区的血清阳性率为5.2％～84.9％~4。2012年,世界动物卫生组织(OIE)将该病列为必须通报的疾病之一,目前,中国尚无有效的疫苗用于控制该病的发生与流行。BVDV 按照生物型可分为非致细胞病变(NCP)型和致细胞病变（CP）型，NCP 型BVDV 在细胞中复制不具有致细胞病变效应,而CP 型 BVDV 能引起细胞空泡及死亡。研究证明,NCP 型 BVDV 能造成感染牛流产及急性、持续性感染(persistent infection, PI)「*7。 PI 牛呈隐性感染,可通过鼻涕、唾液,尿液和乳汁等向外界排毒,使其成为潜在的感染源,当 PI 牛感染发展致 CP 型BVDV时,发生黏膜病,该病致死率 100%8+0]。
研究表明,CP 型 BVDV 感染宿主细胞后,ta-miR-33a.bta-miR-302c、miR-29b"'能特异性靶向BVDV 抑制 BVDV 表达。韩玉霞等通过实时荧光定量 PCR 检测不同生物型 BVDV 感染 MDBK细胞对 SUMO 基因转录水平的影响,发现细胞 SU-MO 系统参与不同生物型 BVDV 在细胞内的活动，且这种调控作用与病毒的生物型存在密切联系。但目前对不同生物型 BVDV 感染宿主细胞差异基因的分析鲜见报道,本试验通过研究不同生物型BVDV 在宿主细胞中的转录、翻译和组装,探讨不同生物型 BVDV 转化的分子机制,旨在阐述 BVDV持续性感染和宿主细胞主动防御 BVDV 机制,为病毒防控新技术和疫苗研发奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
细胞均由山东省农业科学院奶牛研究中心保存。
1.1.1 毒株
NCP/CP 型 BVDV 毒株、MDBkco)、小牛血清、青霉素链霉素,Simply P Total RNx
1.1.2 主要试剂与仪器
DMEM 培养基（Gih、提取试剂盒(Bioflux)、NCP 型 BVDV 直接免疫炎光抗体（VMRD)、AMV Reverse Transcriptag(Promega)、RNase Inhibitor(TaKaRa)。离心机PCR 循环仪、CO。培养箱(SANYO)、荧光显微镜(OLYMPUS CKX41)。
1.2 方法
1.2.1 NCP/CP 型 BVDV 的分离与鉴定本课
题组从山东省济南市周边牛场采集引起牛腹泻的粪拭子,将粪拭子用 PBS 稀释,8 000 r/min 离心5 min,取上清液加相应的青霉素(200 IU/mL)、链霉素(100 μg/mL),用 0.22 μmol/L 微孔滤膜过滤除菌,处理后接种 MDBK 细胞,病毒盲传 3 代观察是否出现细胞病变。
1. 2.2 RNA 提取与 cDNA 的合成
NCP/CP 型 BVDV,用 Simply P Total RNA 提取试剂盒提取 RNA。病毒 RNA 溶液中加人 AMV
Buffer 10μL、dNTPs(10 mmol/L) 4 pL、随机引物1 pL、RRI 1 pL、AMV 反转录酶 2 μL,用 DEPC水补至 50 μL,42 ℃作用 45min,一20 ℃冻存备用。
1.2.3 引物设计与合成
根据 GenBank 中登录的 BVDV 5'参考序列(登录号:NC_001461.1),利用 Primer Premier 5.0 软件设计特异性引物,上游引物序列:5'-ATGCCCWTAGTAGGACTAGCA-3';下游引物序列:5'-TCAACTCCATGTGCCAT-GTAC-3',目的片段大小为 289 bp,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.2.4 PCR扩增
模板 2 pL,Mix 12.5 μL,上,下游引物各 1μL,去离PCR 反应体系 25μL:cDNA子水补至 25 μL。PCR 反应条件：95 ℃预变性20 6,共 35 个循环;72 ℃延伸 10 min。取5 μL反应5 min;95 ℃变性 30 s,58 ℃退火 30 s,72 ℃延伸产物,用 1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
1. 2.5 NCP/CP 型 BVDV 感染宿主细胞将NCP/CP 型 BVDV 分别以 0. 01 MO1 的滴度接种MDBK 宿主细胞,观察接种 BVDV 后细胞生长情况及是否出现细胞病变,同时收集 12～72 h的细胞,每 12 h 收集 1 次，用 PBS 洗涤 3 次，3 000 r/min离心 5 min,一70 ℃保存备用。1.3 NCP/CP 型 BVDV 感染宿主细胞 24、48h转录组学数据分析将收集的 24、48 h 的 BVDV 感染细胞样品及未接种 BVDV 的 MDBK 细胞送北京六合华大基因进行转录组学测定,提取不同时相感染宿主细胞的总 RNA,使用紫外分光光度仪检测总 RNA 进行纯度和浓度的测定。对检测合格的总 RNA 进行 mRNA的富集,之后加入打断试剂,在高温条件下促使mRNA片段化,再以片段化的 mRNA 为模板,合成cDNA,经过磁珠纯化、末端修复、加入测序接头后,进行 PCR 扩增,构建文库;所建文库质粒合格后,使用 IlluminaHiSeq 2000 仪器测序。将所获得的差异基因进行 Gene Ontology 功能显著性富集分析和Pathway 显著性富集分析,对测定结果进行差异分析和挖掘。首先把所有差异表达基因向 Gene Ontology 数据库(http://www. geneontology. org/)的各个 term 映射,计算每个 term 的基因数目,应用超几何检验,找出与整个基因组背景相在差异表达基因中显著富集的 GO 条日,从而分析出差异表达基因与生物学功能的相关性。
2 结果
2.1 不同生物型 BVDV 的分离及鉴定
将分离到的 BVDV 毒株接种 MDBK 细胞,NCP 型 BVDV 感染细胞后未发现细胞病变,用直
接免疫荧光抗体进行鉴定,FITV 标记的 BVDV 抗体与 BVDV 结合,在荧光显微镜下呈现明亮的黄绿色荧光,证明 BVDV 存在(图 1);CP 型 BVDV 感染MDBK 后可见细胞变圆,呈现拉网状(图 2);提取感染细胞进行 RT-PCR 鉴定,产物进行 1.0％琼脂糖凝胶电泳发现,NCP/CP 型 BVDV 均可发现一条约289 bp 的特异性条带,与目的片段大小吻合(图 3)。
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